一、什么是重组胶原蛋白表达

重组胶原蛋白是通过将胶原蛋白的天然基因序列或重新优化设计的基因序列，导入选定的宿主细胞中，如：大肠杆菌和酵母菌，经过培养、发酵、分离纯化等工艺，获得的具有一定天然胶原蛋白特征和主要功能的蛋白质。

简单说，就是基因重组（克隆）

二、蛋白表达系统常用宿主

现阶段表达体系主要以大肠杆菌、酵母为主，而大肠杆菌、酵母等表达体系缺乏动物细胞中胶原蛋白翻译后修饰，需要添加相对应的重组酶。而植物、杆状病毒、哺乳动物细胞表达体系所产生胶原蛋白含量虽然远低于大肠杆菌、酵母体系，但具有完整的三螺旋结构和较好的热稳定性。

不同体系细胞表达优缺点

01 大肠杆菌表达体系

大肠杆菌是一种中等大小的兼性厌氧杆状细菌，是发展最早、应用最广泛的重组蛋白表达系统之一。大肠杆菌表达系统以大肠杆菌细胞作为宿主细胞，通过含有外源基因表达载体的大肠杆菌细胞表达目标蛋白。根据启动子类型，大肠杆菌表达系统分为T7、 Lac/Tac 和 PL/PR 等类型。大肠杆菌表达重组蛋白的工艺通常包括基因工程菌的构建、重组蛋白的表达和纯化等步骤(如下图所示)，具有操作简便、成本低廉、制备周期短、蛋白表达量高等优势。

02 毕赤酵母表达体系

毕赤酵母作为真核细胞，与CHO 细胞高度相似，广泛用于疫苗和药品类蛋白质的生产。与哺乳细胞相比，酵母表达系统价格低廉，表达时间较短的优势，酵母细胞具有生长速度快、能够进行翻译后修饰、可分泌表达和易于遗传操作的特点，是一般公认为安全的菌种（GRAS）。

与其他酵母相比，毕赤酵母所翻译加工的重组胶原蛋白具有二硫键、糖基化、蛋白水解过程等优势特征。

03 植物细胞表达体系

重组胶原蛋白已经在植物系统中成功表达，如玉米(Zea mays) 和烟草植物(Nicotiana tabacum) 中的植物细胞4。通过与羟基化酶共表达能够产生重组I型胶原同源三聚体 (Mr = 70.0–120.0 kDa)，但通常外源蛋白表达量低。

利用植物表达体系生产胶原蛋白与其他体系相比，仍具有产量较低、产能不足的缺点。

04 哺乳动物表达体系

哺乳动物细胞表达体系是利用哺乳动物细胞进行瞬时或稳定表达，或将重组蛋白基因整合到寄主基因组中构建的转基因动物反应器。应用最广的细胞包括小鼠乳腺细胞、纤细肉瘤细胞和胚胎肾细胞。

目前细胞表达体系制备重组胶原蛋白因产量低不能满足工业规模生产的需求，对培养体系要求高，易受病毒感染。而转基因哺乳动物是重组人胶原蛋白可能的高产来源。

三、重组胶原蛋白生产环节

重组胶原蛋白生产的三个环节分别为：

1、生物体的筛选与基因改造；

2、生物发酵过程控制与参数分析；

3、产品分离与纯化

而得到纯化的目的蛋白的首要条件就是细胞破碎

目前常用的细胞破碎方法分为机械法和非机械法，机械法包括高压匀浆法、超声破碎法、球磨法、压榨法等，非机械法包括干燥冷冻法、化学法、物理法等。

四、细胞破碎机释放胞内表达产物

细胞破碎工艺是最直接影响破碎效果的步骤，破碎效果会影响后续目的蛋白的产量、活性以及细胞碎片及小分子杂质的去除。所以，在工业生产中需要选择一种高效简易的破碎方式是非常重要且必要的。高压均质机能够连续运行、不产生二次污染，特别适合工业化的生产使用。而且细菌和酵母细胞通常非常稳定，在释放胞内表达的产物时，将需要>10^6 S-1的剪切力破碎细胞，面对如此高的剪切率，高压均质机可以达到很好的破碎效果。

案例展示：毕赤酵母破碎实验

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